皮内送達されたmRNA

Jun 08, 2024

Nature Biomedical Engineering volume 7、pages 887–900 (2023)この記事を引用

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メトリクスの詳細

メッセンジャー RNA 治療法の成功は、遺伝物質の機能的タンパク質への安全、効果的かつ安定した翻訳を可能にする送達システムの利用可能性に大きく依存します。 今回我々は、ヒト皮膚線維芽細胞から細胞ナノポレーションによって生成された細胞外小胞（EV）と、細胞外マトリックスα1 I型コラーゲン（COL1A1）をコードするmRNAを内包する細胞外小胞（EV）が、コラーゲンタンパク質移植片の形成を誘導し、コラーゲンにおけるしわの形成を減少させることを示す。光老化した皮膚を持つマウスの枯渇した皮膚組織。 我々はまた、マイクロニードルアレイを介したmRNAをロードしたEVの皮内送達が、動物の真皮におけるコラーゲンのより均一な合成と置換を延長させることを示した。 EV ベースの COL1A1 mRNA の皮内送達は、光老化皮膚の治療に効果的なタンパク質補充療法となる可能性があります。

メッセンジャー RNA 修飾技術の最近の開発により、mRNA 送達の治療効率が向上し、タンパク質補充療法や重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) ウイルスに対するワクチン接種など、短期的な臨床応用の可能性が高まりました1。 2. しかし、mRNA は本質的に無能であり、潜在的な免疫原性があるため、mRNA を送達媒体内にカプセル化する必要があります。 現在の mRNA 送達様式は、カプセル化と輸送のための脂質ナノ粒子 (LNP) キャリアの使用に中心を置いています 3,4。 しかし、LNP には、細胞毒性、不十分な体内分布、標的特異性および免疫原性の欠如など、いくつかの大きな課題があります。 これらの問題は、循環半減期を改善し、非特異的クリアランスを減らすために、LNP の表面 PEG 化（PEG はポリ（エチレングリコール）の略）が必要なことが原因である可能性があります 5,6。 特に、人への LNP の投与は、アナフィラキシー、過敏症、自己免疫性の有害事象と関連しています 7,8。 したがって、これらの LNP 関連の課題の一部を克服できる mRNA キャリアの同定は、mRNA ベースの治療法のさらなる開発に役立つと考えられます。

エキソソームや微小胞を含む細胞外小胞（EV）は、人体内での生体分子や mRNA などの核酸の輸送に主要な役割を果たしています9、10、11。 その結果、近年、EV は、その固有の生体適合性、生理学的障壁を通過する能力、および低い免疫原性により、核酸ベースの治療薬の有望なキャリアとして浮上しています 12,13。 LNP とは異なり、エキソソームを含む EV は体の細胞によって内因的に産生され、炎症反応のレベルの低下を引き起こします。 さらに、大量のエクソソームを安価かつ簡単に生産する戦略も開発されています。 我々は以前、ソース細胞の表面に一時的なナノメートル細孔を作成して、分泌されたEVへの完全転写mRNAの大規模なロードを可能にする細胞ナノポレーション（CNP）法を報告しました。 ここでは、ヒトの加齢により損傷した皮膚の病態生理学的特徴をよく模倣した急性光老化のマウスモデルを使用することにより、光老化に対する抗老化治療として、皮膚のコラーゲンタンパク質の損失を代替するエキソソームベースのCOL1A1 mRNA療法の有用性を示します15。肌。 mRNA の送達と保持の効率を向上させるために、ヒアルロン酸 (HA) マイクロニードル (COL1A1-EV MN) パッチを介したコラーゲン mRNA の送達により、真皮内での mRNA のより効率的な分布が可能になり、耐久性のあるコラーゲンが得られることも示しました。 -タンパク質の移植と光老化した皮膚のしわの改善された治療。

コラーゲンの不可逆的な損失による真皮の萎縮は、皮膚の老化の特徴です16,17。 皮膚のコラーゲンタンパク質の損失を回復することを目的とした数多くの方法が、市販薬や医薬品によるアプローチ（抗酸化剤 18、19、20、レチノイド 21、ペプチド 22、23）から医療機器（つまり、レーザー治療 24 や合成皮膚充填剤 25、26）に至るまで多岐にわたります。 。 しかし、これらの既存の技術はどれも、長期にわたる内因性コラーゲンの置換を達成して、皮膚の強度、ハリ、弾力を長期にわたって維持することはできませんでした27、28、29。 コラーゲンタンパク質の合成を担う線維芽細胞を刺激することも、皮膚の老化を短期的に制御する効果的な方法となり得ます30。 しかし、線維芽細胞は老化するにつれて増殖しコラーゲンを合成する能力を徐々に失い、その結果、アンチエイジング治療のための長期的なコラーゲン補充方法が課題となっています31。 これらの限界を克服するために、我々は、EVを介したmRNA送達を介して、光老化コラーゲン枯渇モデルにおいてコラーゲンタンパク質を置き換えることを目的とした。 ヒトコラーゲン I アルファ I (COL1A1) mRNA をロードした EV を生成するために、ナノポア表面上に新生児ヒト皮膚線維芽細胞 (nHDF) の単層をプレーティングし、COL1A1-GFP プラスミドで細胞をナノトランスフェクトすることを含む CNP 技術を採用しました (図 1a および補足図 1a)14。 トランスフェクションの翌日に、EV を培地から単離しました。 CNP 処理細胞は、前述のキュベット型平行電極を使用して実行された標準バルク エレクトロポレーション (BEP) で処理された細胞 32 や、培養中の未処理の nHDF と比較して、細胞当たりの EV 数が 10 倍高いことが判明しました (図.1b)。 各方法で生成されたEVは、ナノ粒子追跡分析（NTA）によって測定された直径約150 nmでピークに達するサイズ分布と、動的光散乱（DLS）によるモードピークの強度の80％によって特徴付けられました（図1cおよび補足）図 1b、c) 多分散指数 (PDI) は 0.12 ～ 0.25 です。 ウエスタンブロット実験により、CNP治療群のエキソソーム（CD9、CD63、TSG101）および微小胞（ARF6）バイオマーカーの発現が未治療群よりも有意に高いことが示され、分泌EVの増加が確認されました（補足図1d）。 動態解析により、電圧最適化されたEV放出はCNP誘導後8時間でピークに達し、次の24時間にわたって継続的な分泌が記録されたことがさらに示されました（補足図1e、f）。 逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（RT-qPCR）により、CNP分泌EVにはBEP分泌EVの200倍以上のCOL1A1 mRNAが含まれ、非トランスフェクト細胞から分泌されたEVの3,000倍のCOL1A1 mRNAが含まれることが示されました（図1d） ）。 ゲルアガロースのバイオアナライザー評価により、約4,000ヌクレオチドで転写された全長COL1A1 mRNAが実証されました（図1e）。 CNP によって調製された EV は、前臨床投与のために 4 °C で保存した場合に構造安定性を示し、クライオ電子顕微鏡 (cryo-EM)、原子間力顕微鏡 (AFM)、および NTA で評価した場合、外観、膜、およびサイズの特性に変化はありませんでした (補足図) .2a–c)。 さらに、EV内にカプセル化されたCOL1A1 mRNAは室温と4℃の両方で安定であり、血清安定性も示し、それにより将来の臨床有用性の可能性を強調しました（補足図2d、e）。